Es la etapa en la cual el substrato es colonizado por el hongo, manteniendo una temperatura optima de 26-30°C Zandrazil, (1989). Durante la incubación, cuatro o cinco días después de haber efectuado la siembra, se hacen de 20-40 perforaciones perfectamente distribuidas (con una aguja o navaja estéril) en la parte superior de la bolsa de polietileno y de preferencia sin tocar al substrato.

Esto se hace por que inicialmente se requiere una concentración alta en CO2 para estimular el crecimiento micelial (hasta niveles cercanos al 25%), pero pasados estos niveles, el CO2 limita el desarrollo y es necesario facilitar el intercambio con aire fresco.

Cuando se usan bolsas de 25kg, cuatro o cinco días después de la siembra, además de las perforaciones mencionadas se hacen alrededor de 15 perforaciones (de 8-10cm cada una) distribuidas en tres hileras a lo largo de la bolsa de substrato. Por estas perforaciones brotarán mas adelante los basidiomas.