Dos corrientes se dan en la literatura religiosa del siglo XVI: la Ascética y la Mística. La primera tiene como fin el perfeccionamiento espiritual por medio del autodominio y la mortificación, y la Mística, la culminación del perfeccionamiento espiritual iniciado por la Ascética. Las dos se engloban en las  tres vías de la escala mística. A la purgativa (purificación por medio de la oración y la imitación de Cristo) pertenece la Ascética, corriente relacionada, entre otras, con la orden franciscana o con las doctrinas erasmistas del siglo XVI y cuyos máximos representantes son, entre otros, Juan de Ávila y fray Luis de Granada; y a las dos restantes, la iluminativa (gracias divinas que favorecen la unión con Dios sin que intervenga la voluntad propia) y la unitiva (unión efectiva del alma con el Altísimo, cuya manifestación más importante es el éxtasis), pertenecen los escritores místicos. Los dos más importantes son santa Teresa de Jesús y san Juan de la Cruz.

Santa teresa de Jesús (1515-1582) nació en Ávila en el seno de una familia cristiana. A los veinte años ingresó en el Carmelo descalzo, cuya reforma llevó a cabo, mientras fundaba convento tras convento en medio de dificultades, viajes horribles y enfermedades constantes. Murió en Alba de Tormes (Salamanca). Fray Luis de León se encargó de publicar en 1588 la mayoría de sus escritos, entre los que destacan: Libro de su vida, especie de autobiografía en la que intercala comentarios sobre la vida interior; Libro de las fundaciones, que narra las adversidades de su labor como fundadora y reformadora; Camino de perfección, tratado ascético dirigido a sus hermanas de orden, y, sobre todo, Las moradas, donde expone sus experiencias místicas. En todas ellas emplea un lenguaje natural, exento de artificios literarios, con muchas comparaciones de tipo cotidiano y refranes y dichos populares.

San Juan de la Cruz (1542- 1591) nació en Fontiveros (Ávila). En Salamanca estudió Artes y Filosofía. Tras un encuentro con Santa Teresa, abrazó el Carmelo y contribuyó a su reforma. Como carmelita descalzo que era, los calzados le hicieron la vida imposible hasta lograr que sufriera prisión en Toledo. Tras salir de la cárcel, su vida fue un ir de un convento a otro en ciudades diferentes: Beas, Baeza, Granada, Peñuela... Aquí fue relevado de su cargo de vicario provincial y vivió casi prisionero. Finalmente, murió en Úbeda.

Su obra poética es excepcional aunque breve: Dos glosas a lo divino (ejemplo: "Sin arrimo y con arrimo"), Tres coplas (ejemplo: "Entréme donde no supe"), Nueve romances (ejemplos: "En el principio moraba", "Encima de las corrientes"), Dos canciones a lo divino (ejemplo: "Qué bien sé yo la fuente que mana y corre"), y las más importantes: Cántico espiritual o Canciones entre el alma y el esposo, Llama de amor viva y Noche oscura del alma, en las que se cumplen las tres vías de la escala mística. En Noche oscura del alma ésta, una vez que el cuerpo está sosegado, purificado (vía purgativa), inicia un camino hacia la luz, que nada tiene que ver con la del día. En Cántico espiritual, el alma va buscando al esposo en las criaturas de la naturaleza, y éstas le contestan que en la belleza que tienen está Él. Finalmente, en Llama de amor viva, tiene lugar la unión apasionada del alma con Dios:

"¡Oh llama de amor viva,
que tiernamente hieres
de mi alma en el más profundo centro!..."

Si en el fondo san Juan de la Cruz se inspira preferentemente en la Biblia, respecto del  estilo, es algo más complejo. Si en general emplea la lira de Garcilaso para modular la exquisita y musical expresión de la mayoría de sus composiciones, también es verdad que cada una de sus obras lleva un sello especial. En Cántico espiritual, por ejemplo, destacan las imágenes y el colorido; en Noche oscura del alma, la delicadeza misteriosa con que se expone  la búsqueda de Dios que efectúa el alma valiéndose sólo de la luz de su corazón; en Llama de amor viva, la deslumbrante y exquisita manera de pintar la pasión amorosa. Etcétera. Pero hay que añadir un rago de san Juan de la Cruz hasta el momento ausente en los poetas del siglo XVI, y es el empleo de variedad de símbolos; así, la naturaleza que aparece en sus versos: montes, ríos, valles, fronteras, fuentes... le sirven al poeta para representar el mundo espiritual (tentaciones, pecados, virtudes...).