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Capítulo 3:

 Cepas de reserva y de trabajo

Las cepas de reserva

Se considera cepas de reserva, aquellas cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.

Las cepas de reserva son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del cual se destina un luga r para su almacenaje, señalando claramente de que se trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulación queda exclusivamente restringida al personal autorizado.

Métodos para la preservación y mantenimiento de las cepas de reserva

Los métodos para la preservación y mantenimiento de cepas de reserva obtenidas a partir de cepas de referencia son la LIOFILIZACIÓN y la CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

Se da el uso de agentes Crioprotectores

La Liofilización

Esta se define como el proceso de desecación desde el estado congelado.

Los Agentes Crioprotectores:

·       Leche descremada de calidad microbiológica, con proceso de esterilización por vapor fluente, al 10% o 20% P/V. Asimismo, puede añadirse aditivos tales  como el inositol.

·       Dicho producto puede conservarse en refrigeración o a temperatura ambiente por años.

Congelación a baja temperaturas

·          Agentes Crioprotectores:

1.       Leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.

2.       Aditivos, del tipo del Inositol.

3.       Glicerol al 10%.

4.       Caldo BHI con glicerol 20%.

·          Proceso de congelación:

a.       Equipamiento o insumos para lograr la congelación

·          Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.

b.      Proceso de congelación

·          Temperaturas de congelación:

La temperatura de congelación ideal es de  -70° o -80° C,  e incluso menor temperatura. En el caso de temperaturas superiores, como los  -20° C, se considera como no ideal aunque podría ser la única forma posible; no obstante es preferible -40° C.

·          Envases:

Los envases utilizados son el criovial o tubo estéril.

·          Conservación del producto:

Su conservación puede darse a temperatura congelación por años.

·          Posibles inconveniente:

Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelación son entre otros:

1.       problemas y pérdida de las cepas,

2.       la falta de suministro de energía,

3.       falta de insumos,

4.       avería del equipamiento.

La preservación y mantenimiento de cepas de reserva

En la conservación y modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica, es primordial  tener en cuenta los conocimientos fundamentales microbiológicos, suministrar condiciones ajustadas para cada tipo de microorganismo, así mismo, tener en cuenta que con cada subcultivo, existe un riesgo de mutación de la cepa y para ello debe evitarse el crecimiento.

Factores determinantes de la viabilidad de la cepa

Los factores que determinan la viabilidad de las cepas, la cuales están sometidas al proceso de congelación para su reserva, son:

·     el tipo de cepa, así por ejemplo que la resistencia de las bacterias Gram positivas es mayor que en el caso de las Gram negativas, y

·     las óptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.

Condiciones previas a la exposición de bajas temperaturas

Las condiciones previas que ha de tenerse en cuenta a la exposición de bajas temperaturas de las cepas son:

·          La edad del cultivo

-          la capacidad del microorganismo de sobrevivir puede verse afectada por la edad del cultivo.

-          Los cultivos muy jóvenes o muy viejos muestran menor resistencia al shock térmico.

-          La edad idónea corresponde con el fin de la etapa logarítmica, siendo el principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperación, siendo el de los microorganismos en general de 24 horas de incubación a 37º C.

·          Las condiciones de desarrollo

Estas son consideradas primordiales. Así observamos, por ejemplo, como las levaduras que crecen aireadas y agitadas gozan de una mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrolladas en un medio sólido.

Igualmente, se deben respetar y observar las instrucciones dadas por los fabricantes de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente.

Como  ejemplo, observamos la supervivencia de los microorganismos almacenados a -20º C en Mast Cryobank (Ref.: Mast Cryobank TM, ETICOR)

*     Microorganismo.............................................................................. Supervivencia

·         Enterobacter aerogenes................................................................................. 48 meses

·         Pseudomona aeruginosa............................................................................... 18 meses

·         Salmonella typhimurium................................................................................. 48meses

·         Staphylococcus aureus...................................................................................48meses

·        Listeria monocytogenes....................................................................................48 meses

·         Listeria ivanovii................................................................................................48 meses

·         Rhodococcus equi..........................................................................................48 meses

·        Bacillus cere us................................................................................................24meses

·         Clostridium perfringes.....................................................................................48 meses

Procedimientos a seguir en las cepas de reserva

1.       Previo a la inoculación, se rotulan  los tubos o crioviales donde se almacenan las cepas reserva. En cada criovial queda la siguiente información:

·          Identificación de la cepa

·          Tipo y Nº de colección

·          Nº de repique

·          Fecha de realización del C. res. (cepa de reserva)

·          Fecha de vencimiento del criovial

·          Nº de tubo o criovial

2.       El desarrollo microbiano logrado, se inocula asépticamente en el medio líquido sobrenadante que contienen los crioviales.

3.       Congelar o liofilizar la cepas de reserva.

4.       Manipulación de la cepa de reserva a fin de obtener cepas de trabajo. En el caso de las cepas congeladas de crioviales, se debe realizar este paso para prevenir el descongelamiento y la contaminación del criovial a través del traslado en su propia caja termostatizada y que repique en campana de flujo laminar.

Asimismo, ha de observarse que

·          En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva, no se deben volver a congelarse.

·          El criovial vencido es eliminado del cepario y se registra.

·          Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores, se utilizan, se descongelan y no se volverá a congelar ni a usar.

·          Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.

Registro de cepas de reserva

·          Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo.

·          TIPO y Nº de colección.

·          Nº de Lote Cepa referencia.

·          Nº de criovial o vial.

·          Fecha de reconstitución de la Cepa referencia.

·          Nº de repique.

·          Frasco en uso.

·          Fecha de baja criovial.

·          Ubicación de almacenamiento.

·          Observaciones

Las cepas de trabajo

Las cepas de trabajo son los Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva a fin de ser empleados en los ensayos que hagan falta.

Obtención de cepas de trabajo:

·          Los cultivos de trabajo se consiguen a partir de la Cepas de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado manejando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas.

·          Las cepas de trabajo no convienen ser subcultivadas.

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