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Capítulo 6:

 Técnicas microbiológicas

2.4.2 Técnicas microbiológicas

Las técnicas microbiológicas se utilizan para detectar si hay microorganismos sobre una muestra y para identificarlos y cuantificarlos. Por tanto, el primer paso en el estudio microbiológico será aislar las diferentes especies de microorganismos que haya en la muestra.

2.4.2.1 La siembra

La técnica para el aislamiento comienza preparando un inóculo de siembra, que es la deposición de una pequeña porción de la muestra en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en función de las especies microbianas que se espera encontrar.

Por eso existen distintos métodos o tipos de siembra, en función de la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculación y la siembra para aislamiento.

- Siembra para inoculación
: La inoculación consiste en tomar una pequeña porción de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con más facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio líquido o en medio sólido.

- Siembra para aislamiento
: La finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo sólidos. Existen varios tipos de siembras para aislamiento: Siembra en estría o zig-zag, siembra por estría múltiple, siembra de los cuatro cuadrantes, siembra de los tres giros.

2.4.2.2 La observación

Para estudiar la forma y la movilidad de los microorganismos, es necesario observarlos mientras están vivos. Además, los cultivos que han de estudiarse han de ser recientes - jóvenes- ya que los microbios de los cultivos antiguos -viejos- pierden movilidad. Las técnicas utilizadas para la observación son el examen en fresco, la coloración y la tinción.

- Examen en fresco: Pueden seguirse dos métodos:

* Método de la gota pendiente.
* Método de la cámara húmeda.

- Coloración: La coloración pone de manifiesto detalles estructurales de los microorganismos, que no es posible apreciar en la observación en fresco. Se utilizan colorantes muy diluidos, que propiamente no tiñen, sino que se acumulan en ciertas estructuras del microbio. Los más comunes de estos son el rojo neutro, el azul de metileno y la nigrosina. La técnica consiste simplemente en depositar una gota del colorante diluido en el portaobjetos y depositar sobre ella una gota de suspensión del microorganismo, mezclándolas cuidadosamente. Se tapa la preparación con el cubreobjetos y se observa al microscopio.

2.4.2.3 Tinción

Las tinciones permiten ver con detalle los microorganismos, de forma que se aprecian las características que los diferencian a unos de otros. Además de permitir la observación las tinciones se utilizan como prueba de identificación. Mediante la respuesta a determinadas tinciones conoceremos características que nos permitirán la identificación de los microorganismo: Gram +, lactosa -...

Los peores obstáculos de la tinción, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del técnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la técnica. A continuación describimos algunas de las fuentes de error:

- Impurezas en los reactivos de tinción.
- Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.
- pH inadecuado. El colorante se fija a la célula por mecanismos físico-químicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado. Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros.
- Tiempo de tinción incorrecto.
- Temperatura suficiente.

* Etapas del proceso de tinción


1. Extensión. Para obtener una película fina de muestra, que puede observarse al microscopio.
2. Desecación. La muestra se deseca por el calor suave de la exposición intermitente a las cercanías de una llama.
3. Fijación. Consigue la muerte del microorganismo por coagulación de sus proteínas y deja la preparación adherida al portaobjetos. Se puede realizar bien por inmersión en una solución fijadora bien por exposición a vapores de un compuesto fijador.
4. Tinción. El microorganismo se tiñe con los colorantes adecuados.
5. Lavado. Para eliminar el exceso de colorante.
6. Secado de la preparación.

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