2.4.2 Técnicas microbiológicas
Las técnicas microbiológicas se utilizan para detectar si hay
microorganismos sobre una muestra y para identificarlos y
cuantificarlos. Por tanto, el primer paso en el estudio
microbiológico será aislar las diferentes especies de
microorganismos que haya en la muestra.
2.4.2.1 La siembra
La técnica para el aislamiento comienza preparando un inóculo de
siembra, que es la deposición de una pequeña porción de la muestra
en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en función de las
especies microbianas que se espera encontrar.
Por eso existen distintos métodos o tipos de siembra, en función de
la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la
finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculación y
la siembra para aislamiento.
- Siembra para inoculación: La inoculación consiste en tomar
una pequeña porción de la muestra y diluirla para dispersarla y que
crezca con más facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular
en medio líquido o en medio sólido.
- Siembra para aislamiento: La finalidad de este tipo de
siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de
Petri que contienen medios de cultivo sólidos. Existen varios tipos
de siembras para aislamiento: Siembra en estría o zig-zag, siembra
por estría múltiple, siembra de los cuatro cuadrantes, siembra de
los tres giros.
2.4.2.2 La observación
Para estudiar la forma y la movilidad de los microorganismos, es
necesario observarlos mientras están vivos. Además, los cultivos
que han de estudiarse han de ser recientes - jóvenes- ya que los
microbios de los cultivos antiguos -viejos- pierden movilidad. Las
técnicas utilizadas para la observación son el examen en fresco, la
coloración y la tinción.
- Examen en fresco: Pueden seguirse dos métodos:
* Método de la gota pendiente.
* Método de la cámara húmeda.
- Coloración: La coloración pone de manifiesto detalles
estructurales de los microorganismos, que no es posible apreciar en
la observación en fresco. Se utilizan colorantes muy diluidos, que
propiamente no tiñen, sino que se acumulan en ciertas estructuras
del microbio. Los más comunes de estos son el rojo neutro, el azul
de metileno y la nigrosina. La técnica consiste simplemente en
depositar una gota del colorante diluido en el portaobjetos y
depositar sobre ella una gota de suspensión del microorganismo,
mezclándolas cuidadosamente. Se tapa la preparación con el
cubreobjetos y se observa al microscopio.
2.4.2.3 Tinción
Las tinciones permiten ver con detalle los microorganismos, de
forma que se aprecian las características que los diferencian a
unos de otros. Además de permitir la observación las tinciones se
utilizan como prueba de identificación. Mediante la respuesta a
determinadas tinciones conoceremos características que nos
permitirán la identificación de los microorganismo: Gram +, lactosa
-...
Los peores obstáculos de la tinción, que impiden conseguir el
resultado perseguido, son los errores del técnico. Para evitarlos
hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar
la técnica. A continuación describimos algunas de las fuentes de
error:
- Impurezas en los reactivos de tinción.
- Concentración inadecuada de los reactivos de tinción.
- pH inadecuado. El colorante se fija a la célula por mecanismos
físico-químicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado. Los
colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros.
- Tiempo de tinción incorrecto.
- Temperatura suficiente.
* Etapas del proceso de tinción
1. Extensión. Para obtener una película fina de muestra, que
puede observarse al microscopio.
2. Desecación. La muestra se deseca por el calor suave de la
exposición intermitente a las cercanías de una llama.
3. Fijación. Consigue la muerte del microorganismo por
coagulación de sus proteínas y deja la preparación adherida al
portaobjetos. Se puede realizar bien por inmersión en una solución
fijadora bien por exposición a vapores de un compuesto
fijador.
4. Tinción. El microorganismo se tiñe con los colorantes
adecuados.
5. Lavado. Para eliminar el exceso de colorante.
6. Secado de la preparación.
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